تحليل الدهون في الخلايا الحية: طفرة جديدة في الفحص المجهري الضوئي الصوتي بالأشعة تحت الحمراء المتوسطة الطيفية

الدهون ليست فقط مكونات هيكلية لأغشية الخلايا وجزيئات تخزين الطاقة، ولكنها أيضًا ترتبط ارتباطًا وثيقًا بحدوث وتطور السرطان والسمنة والسكري وأمراض القلب والأوعية الدموية وأمراض التنكس العصبي. ومع ذلك، فإن المراقبة المباشرة والتمييز بين أنواع مختلفة من الدهون في الخلايا الحية واجهت تحديات تقنية منذ فترة طويلة. تقتصر طرق وضع العلامات الفلورية التقليدية على كفاءة وضع العلامات والنوعية والتداخل المحتمل مع الوظائف الخلوية، في حين أن التقنيات البصرية الخالية من الملصقات غالبًا ما تكافح لتمييز جزيئات الدهون ذات الهياكل الكيميائية المماثلة.

نشرت مجلة Nature Methods دراسة تقدم تقنية تسمى "المجهر الصوتي الضوئي لمنطقة بصمة الإصبع الفائقة الطيفية" (hyFOPM). من خلال الاستفادة من أوضاع الاهتزاز أحادية الرابطة في منطقة بصمة الأشعة تحت الحمراء المتوسطة، تتيح هذه التقنية الكشف بدون ملصقات والتصوير الديناميكي للسفينغوميلين (SM) والكوليسترول (Chol) في الخلايا الحية.

المبادئ الفنية
تعتمد معظم الطرق البصرية الخالية من الملصقات على إشارات في منطقة اهتزاز تمديد CH (حوالي 2800-3000 سم⁻¹)، لكن النطاقات الطيفية في هذه المنطقة متشابهة إلى حد كبير عبر الدهون المختلفة، مما يجعل من الصعب التمييز بين الأنواع المختلفة. في المقابل، تحتوي منطقة بصمة الأشعة تحت الحمراء المتوسطة (900-1730 سم⁻¹) على المزيد من معلومات اهتزاز الرابطة الفردية التي تعكس البنية الفريدة للجزيئات، مثل الامتصاص المميز لروابط الأميد، وروابط الإستر، وحلقات الستيرويد.

يركز تصميم نظام hyFOPM على هذا المفهوم. يستخدم ليزرًا كميًا متتاليًا قابلاً للضبط كمصدر للإثارة، ويغطي نطاق 900-2932 سم⁻¹ مع دقة طيفية تبلغ 2 سم⁻¹. تثير نبضات الليزر العينة لتوليد إشارات صوتية ضوئية، والتي يتم اكتشافها بواسطة محول طاقة بالموجات فوق الصوتية لإنشاء صور فائقة الطيف. يتمتع النظام بدقة مكانية تبلغ حوالي 4.3 ميكرومتر، مما يتيح التصوير على مستوى الخلايا الحية.

التحقق من صحة نماذج الدهون
للتحقق من جدوى هذه التكنولوجيا، قام فريق البحث أولاً بإعداد نماذج محلول دهني ثنائي الأبعاد يحتوي على الكوليسترول (Chol)، والفوسفاتيديل كولين غير المشبع (DOPC)، والسفينغوميلين (SM).

(1) مقارنة الميزات الطيفية

تتوافق أطياف منطقة بصمات الأصابع التي تم جمعها بواسطة hyFOPM بشكل كبير مع نتائج ATR-FTIR. تظهر الدهون الثلاثة قمم طيفية مميزة: يمثل الكوليسترول ذروة امتصاص قوية لتشوه حلقة الستيرويد عند 1056 سم⁻¹؛ يتميز DOPC باهتزاز تمديد C=O لمجموعة الإستر عند 1731 سم⁻¹؛ ويتوافق السفينغوميلين مع نطاق الأميد I، ونطاق الأميد II، واهتزاز انحناء الأحماض الدهنية CH₂ عند 1645 سم⁻¹، و1555 سم⁻¹، و1464 سم⁻¹، على التوالي.

(2) القدرة على الفصل والتصنيف الطيفي
عند استخدام 15 رقمًا موجيًا فقط في منطقة بصمة الإصبع للفك الخطي، فإن الحديث المتبادل بين الكوليسترول والسفينغوميلين يقترب من 0%، في حين أن الحديث المتبادل لـ DOPC هو 23%. في المقابل، يزداد الحديث المتبادل بشكل ملحوظ عند استخدام 7 أرقام موجية في منطقة تمديد CH. يوضح التطبيق الإضافي للتحليل التمييزي الخطي (LDA) أن متوسط ​​دقة التصنيف يصل إلى 96% عند استخدام منطقة بصمة الإصبع أو منطقة CH، ويصل إلى 97% عند استخدام جميع أرقام الموجات.

(3) نماذج الحويصلة وحيدة الصفيحة العملاقة (GUV).
أعدت الدراسة ثلاثة أنواع من GUVs لمحاكاة أغشية الخلايا: النموذج 1، خليط 1:1 من SM وChol، يشكل غشاء مرتبًا كثيفًا؛ النموذج 2، خليط 2:2:1 من DOPC، SM، وChol، يتعايش في مراحل مرتبة بالسائل ومراحل مضطربة بالسائل؛ والنموذج 3، DOPC النقي، الذي يشكل غشاء سائل مضطرب. الصور التي تم الحصول عليها بواسطة hyFOPM عند 2852 سم⁻¹ متوافقة شكلياً مع تلك التي تم الحصول عليها عن طريق تلوين الفلورسنت النيلي الأحمر. تتوافق الخصائص الطيفية للحويصلات المختلفة مع الدهون النقية، مما يؤكد إمكانية تحديد المكونات الفردية في الأغشية المختلطة.

(4) تطبيقات مراقبة الجودة
من خلال إجراء قياسات طيفية على 10 وحدات GUV مختلفة لكل نوع ورسم مخططات الطور الثلاثي، وجد فريق البحث أن تكوين الدهون الفعلي انحرف عن النسبة المستهدفة (تناقض يبلغ حوالي 40٪). يشير هذا إلى أنه يمكن استخدام hyFOPM لتقييم الجودة في إعداد GUV.

تطبيقات في الخلايا الحية
كما طبقت الدراسة hyFOPM على الخلايا الحية، مع ملاحظة التغيرات الديناميكية للسفينغوميلين والكوليسترول في نموذجين من الخلايا، على التوالي.

(1) تراكم السفينغوميلين في خلايا A549
تم علاج خلايا سرطان الرئة الغدية البشرية (A549) باستخدام حمض 2-هيدروكسيوليك المضاد للأورام (2-OHOA)، والذي من المتوقع أن يحفز تراكم السفينغوميلين. تم جمع أطياف منطقة بصمة الإصبع (1600-1400 سم⁻¹) من 50 خلية، مما يدل على أن منطقة الذروة البالغة 1464 سم⁻¹ زادت بنسبة 117% بعد العلاج، مقارنة بـ 23% فقط في المجموعة الضابطة خلال نفس الفترة. بعد ذلك، تم إجراء التصوير على 3000 خلية باستخدام أربعة أرقام موجية فقط (2852 سم⁻¹ لإجمالي الدهون، 1540 سم⁻¹ للبروتين أميد II، 1464 سم⁻¹ للسفينغوميلين، و1048 سم⁻¹ للكوليسترول). وأظهرت النتائج أن إشارة السفينغوميلين استمرت في الارتفاع بعد 48 و72 ساعة من العلاج، في حين لم تظهر إشارة الكوليسترول أي تغيير ملحوظ.

(2) تحميل الكوليسترول في خلايا HEK
تمت تحضين خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK293) مع مركب ميثيل - بيتا - سيكلودكسترين - كوليسترول (MβCD-Chol) لزيادة نسبة الكوليسترول في غشاء الخلية. أظهر أطياف منطقة بصمة الإصبع المكونة من 50 خلية أن منطقة الذروة البالغة 1048 سم⁻¹ زادت بنسبة 161% بعد العلاج، في حين انخفضت ذروة السفينغوميلين البالغة 1464 سم⁻¹ بشكل طفيف - بما يتوافق مع الخاصية المعروفة المتمثلة في أن الدكسترين الحلقي يستخرج بعض الدهون الغشائية أثناء توصيل الكوليسترول. أكد التصوير متعدد الموجات لـ 3000 خلية أيضًا ارتفاع إشارة الكوليسترول، مع زيادة طفيفة في إشارة الدهون الإجمالية وتغيير طفيف في إشارة البروتين.

الأهمية والتوقعات
توضح هذه الدراسة القدرة على تمييز جزيئات الدهون ذات التركيبات الكيميائية المماثلة في الخلايا الحية دون وضع علامات عليها. بالمقارنة مع الأساليب التقليدية التي تعتمد على وضع العلامات الفلورية أو النظائرية، يتجنب hyFOPM مشكلات مثل كفاءة وضع العلامات والتداخل مع الوظائف الخلوية، ويمكن تكييف انتقائيته بمرونة مع السمات الطيفية للدهون المستهدفة عن طريق ضبط أرقام موجة الإثارة.

تتفوق الخصوصية الطيفية للنظام الحالي في منطقة بصمات الأصابع على تلك الموجودة في منطقة تمديد CH، مما يفتح إمكانيات التمييز بين المزيد من الأنواع الفرعية للدهون. وتشير الدراسة أيضًا إلى أنه من المتوقع أن يؤدي الجمع بين تقنيات فك الطيف المتقدمة، مثل التعلم العميق، إلى تحسين الحساسية والنوعية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يصل الفحص المجهري الضوئي الصوتي بالأشعة تحت الحمراء المتوسطة إلى عمق تصوير يزيد عن 150 ميكرومتر في الأنسجة، ويمكن توسيع التطبيقات المستقبلية لتشمل عينات سميكة أو في إعدادات الجسم الحي. يعد التسريع التكنولوجي (على سبيل المثال، المعاينة الطيفية) وتصغير النظام من الاتجاهات المهمة لتطوير هذه التكنولوجيا نحو تحليل نقطة الرعاية أو الاختبارات المعملية الروتينية.